WB을 위한 Protein Lysis buffer & Protein 종류별 Isolation Kit

WB을 위한 Protein Lysis buffer & Protein 종류별 Isolation Kit 종류 살펴보세요.

1. Lysis buffer Gel Running을 위한 샘플 준비를 하기 위해서는 Cell 과 Tissue에서 원하는 Protein 이 나올 수 있도록 Lysis 되어야 합니다. 이렇게 용해된 Protein들은 separating gel을 통하여 각각 분리되어 질 수 있습니다. Lysis buffer를 만들기 위한 많은 Recipes들이 존재하는데, 그 중 몇 가지들은 Western blot을 위한 buffer들 입니다. 하지만 buffer들은 Protein을 녹이는 ability가 각각 다른데 이들 중 일부는 SDS를 포함하고 있고, 또 다른 buffer들은 비교적 강한 ionic detergents를 포함하고 있습니다. 대부분의 antibody들은 reduced 혹은 denatured 상태의 Protein을 인식할 수 있습니다. 하지만 어떤 antibody들은 denatured 된 Protein을 인식하지 못하는 경우가 있기 때문에 antibody의 특징을 미리 알고 있어야 합니다. 따라서 Lysis buffer를 선택할 때 먼저 고려해 봐야 할 사항은 antibody가 denatured protein을 인지하는 확인하는것 입니다. 만약 denatured protein을 인식하는 antibody가 아니라고 하면 antibody datasheet를 살펴보고, detergent가 없거나 비교적 mild non ionic detergents(NP-40, Triton X-100)을 사용해 줘야 합니다. Protein location and lysis buffer choice Protein location Buffer recommended Whole Cell NP-40 or RIPA Cytoplasmic (soluble) Tris-HCI Cytoplasmic (cytoskeletal bound) Tris-Triton Membrane bound NP-40 or RIPA Nuclear RIPA or use unclear fraction protocol Mitochondria RIPA or use mitochondrial fraction protocol Lysis Buffer 의 조성 Lysis buffer 조성 특징 Nonidet-P40 (NP40) buffer 150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 (Triton X-100 can be substituted for NP-40) 50 mM Tris, pH 8.0 This is a popular buffer for studying proteins that are cytoplasmic, or membrane-bound, or for whole cell extracts. If there is concern that the protein of interest is not being completely extracted from insoluble material or aggregates, RIPA buffer may be more suitable, as it contains ionic detergents that may more readily bring the proteins into solution. RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer) 150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 or Triton X-100 0.5% sodium deoxycholate 0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate) 50 mM Tris, pH 8.0 RIPA buffer is also useful for whole cell extracts and membrane-bound proteins, and may be preferable to NP-40 or Triton X100-only buffers for extracting nuclear proteins. It will disrupt protein-protein interactions and may therefore be problematic for immunoprecipitations/pull down assays. Tris-HCl buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5   Tris-Triton buffer 10 mM Tris, pH 7.4 100 mM NaCl 1 mM EDTA 1 mM EGTA 1% Triton X-100 10% glycerol 0.1% SDS 0.5% deoxycholate Cytoskeletal proteins 2. Protease and phosphatase inhibitors Lysis 가 일어나자 마자 Proteolysis, dephosphorylation , denaturation 과정이 일어나기 시작합니다. 이러한 과정들은  샘플들을 4°C 에 유지하면서 그 과정들을 늦출 수가 있거나 혹은 적절한 Inhibitor을 lysis buffer에 첨가함으로써 늦출 수가 있습니다. 여러 회사들로부터 Ready to use  형태의 inhibitor cocktail 들이 판매되고 있으며, Lab에서도 만들어서 사용할 수 있습니다. <Inhibitor의 종류> Inhibitor Protease/phosphatase Inhibited Final concentration in lysis buffer Stock (store at -20℃) Aprotinin Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin 2 ug/ml Dilute in water. 10 mg/ml. Do not re-use thawed aliquots. Leupeptin Lysosomal 5-10 ug/ml Dilute in water. Do not re-use once defrosted. Pepstatin A Aspartic proteases 1 ug/ml Dilute in methanol. 1mM PMSF Serine, Cysteine proteases 1 mM Dilute in ethanhol. You can re-use the same aliquot. EDTA Metalloproteases that require Mg++ and Mn++ 5 mM Dilute in dH2O, 0.5M. Adjust pH to 8.0 EGTA Metalloproteases that require Ca++ 1 mM Dilute in dH2O, 0.5M. Adjust pH to 8.0 Na Fluoride Serine/Threonine phosphatases 5-10 mM Dilute in water. Doo not re-use once defrosted. Na Orthovanadate Tyrosine phosphatases 1 mM Dilute in water. Doo not re-use once defrosted. 3.Gendepot 사의 Protein lysis buffer 종류 제품명 용량 Cat no. 10X PBS Buffer , pH 7.4 500ml P2100-050 Tween 20, Molecular Biology Grade 100ml T9100-100 TritonX-100 100ml T9500-100 RIPA Cell Lysis Buffer (1X) With EDTA 100ml R4100-100 RIPA II Cell Lysis Buffer with Triton, (1X), Without EDTA 100ml R4200-100 AffiSelect Total Protein Extraction Solution (Protein Inhibitor cocktail 이 포함되어 있는 Lysis buffer) 15X1ml A0710-015 NP-40 Lysis Buffer (2X) 100ml N1200-100 Prolysol BC Protein extraction buffer, Bacteria (backterial lysis buffer) 100ml P4100-100 Protease Inhibitor Cocktail I (10X), Tablets 5X1ml P5100-005 Protease Inhibitor Cocktail II, EDTA Free (10X), Tablets 5X1ml P5101-005 Protease Inhibitor Cocktail III, (100X), Lyophilized 1ml P5102-001 5. Qiagen 사의 Protein 종류별 Isolatin kit Products Details Cat No. ▶Total Protein Qproteome FFPE Tissue Kit (20) Formalin-fixed paraffin embedded tissue에서 full-length protein을 분리 37623 Qproteome FFPE Tissue Kit (100) 37625 Qproteome Mammalian Protein Prep Kit(100) mammalian cells에서 total protein을 분리정제 37901 Qproteome Bacterial Protein Prep Kit(4.5L) soluble bacterial proteins 을  분리 37900 AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit (50) cell 혹은 tissue에서 DNA, RNA, protein을 동시에 분리 80004 AllPrep RNA/Protein Kit (50) cultured cell 에서 total RNA와 protein를 동시에 분리 80404 ▶Selective Depletion Qproteome Albumin/IgG Depletion Kit(6) Human의 serum, plasma로 부터 albumin과 IgG를 제거 37521 Qproteome Murine Albumin Depletion Kit(6) Mouse와 rat의 serum, plasma로 부터 albumin을 제거 37591 ▶Isolation Sub-Proteoms    Localization & Organelles Qproteome Cell Compartment Kit(10) Cell 혹은 tissue에서 cytosol, membrane, nucleus, cytoskeleton에 존재하는 protein을 분리 37502 Qproteome Nuclear Protein Kit(12) Nuclear와 Nucleic acid binding proteins을 분리정제 37582 Qproteome Mitochondria Isolation Kit(12) Mitochondria를 효율적으로 분리 37612 Qproteome Plasma Membrane Protein Kit(6) Plasma membrane protein을 분리 37601    posttranslational modifications PhosphoProtein Purification Kit (6) Affinity chromatography를 통하여 phosphorylated와 unphosphorylated proteins을 분리 37101 Qproteome Total Glycoprotein Kit(6) Glycosylated proteins을 분리 37541 Qproteome Mannose Glycoprotein Kit(6) ConA, GNA, and LCH Lectin Spin Columns (2 each) mannose-rich glycan moieties가 포함된 glycoproteins 37551 Qproteome Sialic Glycoprotein Kit(6) WGA, SNA, and MAL Lectin Spin Columns (2 each) sialic-acid-rich glycan moieties가 포함된 glycoproteins 37561 Qproteome O-Glycan Glycoprotein Kit(6) AIL and PNA Lectin Spin Columns (3 each) 37571

http://www.dawinbio.com/nlbc/essential/read.html?board_code=a1135&num=7&page=1&list_num=12